青花菜(Brassica oleracea L.var.italica)，十字花科芸薹属，源于意大利，是甘蓝的变种，又名青花椰菜、意大利花菜、意大利芥蓝、木立花椰菜等。青花菜含丰富的蛋白质、糖、脂肪、维生素和胡萝卜素等营养成分，具有良好抗癌效果，居同类蔬菜之首，深受广大消费者喜爱的保健蔬菜。
　　游离小抱子培养技术始于20世纪70年代初，1982年Lichter首次成功应用在芸墓属作物甘蓝型油菜上，自此该技术已在芸薹属多种作物上得到广泛的运用和发展。通过游离小孢子培养可以快速获得DH(Doubled Haploid)株系，既可应用于育种，较常规自交选育加速了育种进程并提高了选择的效率；同时也为进行遗传结构分析的提供了很好的材料；此外，由于小孢子单倍体的特殊性，还可以通过诱变和遗传转化等方法开展抗病育种方面的工作。相对于甘蓝型油菜、结球白菜等作物，青花菜游离小孢子的培养技术难度大，Takahata Y&Keller W A（1991）最早发表了青花菜小孢子培养方面的报道，此后，很多学者对青花菜小孢子培养技术体系进行了优化和改良。虽然众多学者进行了巨大的努力，使该技术得到了飞速的发展，但依然存在基因型间差异大、胚胎诱导率低、试验重复性差等问题，导致在青花菜小孢子培养上到目前为止还没有建立起一套高效、稳定、广泛实用的技术体系。游离小孢子培养的成功与否关键在能否诱导胚胎发生以及胚的产量的高低，而它受到供体植株、预处理、培养基成分、试验操作等因素的影响。本文以广大学者的研究为基础，着重从影响小孢子胚胎发生较大几个因素对青花菜小孢子培养技术进行探讨，以期为建立高效的青花菜小孢子培养技术提供参考依据。
　　1 供体植株的因素
　　1.1供体植株的基因型
　　植株基因型间的差异是影响游离小孢子胚胎发生的主要限制因素，不仅存在于不同物种间，同一种作物不同品种间差异也很明显，主要体现在2个方面（1）该材料能否诱导出胚胎；（2）该材料诱导出胚胎产量高与低。目前已有研究报道（表1）显示不是所有的材料都能诱导出胚胎，且出胚材料间的出胚量差异较大。比如，张延国和王晓武（2005）利用11份青花菜一代杂种进行游离小孢子培养，其中6份材料获得胚状体，且出胚材料差异也明显，效果最好的能达到25.28个/蕾，差的仅0.04个/蕾[44]。再比如，宋立晓等（2010）以13份材料进行培养，其中只有8份材料获得了胚状体，且最高出胚是最低的42倍。
表1青花菜小孢子培养胚胎发生相关影响因子及结果统计
控制胚胎发生的能力是由少数核基因控制，且诱发胚胎发生难易程度的这一重要特征具有遗传性，能从易出胚基因型转移到顽抗性基因型植株上。Rudolf等(1999)将具有胚发生能力的甘蓝品种与无胚发生能力的白菜杂交，后代发现，1/3为中间型，2/3具有超亲现象。不过在青花菜小孢子培养方面，关于该特性遗传研究的报道还没有。
　　1.2供体植物的生理状况
　　供体植株的生长环境特别是温度对供体植株的生理状况影响深远，是影响小孢子孤雄发育潜力关键因子。大多数情况下，从低温环境下生长的植株上取材能获得更多的小孢子胚数量。方淑桂等（2005）研究表明：青花菜供体植株在自然生长条件下，采蕾前1周的最适温度为15-25℃，低于12℃或高于28℃均不利于小孢子胚胎诱导。大多数学者在进行青花菜游离小孢子培养时，将供体植株生长在人工气候室内或控制在适宜的温度下，一般昼/夜温度保持在15-25℃/4-18℃下，易培养获得胚。与其他学者在甘蓝、白菜等作物上研究结果基本一致。这可能与供体植株在低温稳定环境下，小孢子发育同步性强、生理活性高，而大田材料同步性差，污染大、小孢子活力差有关系。此外，除了温度影响植物的生理状况，植株的取材部位（主花序，侧花序），开花时期（初期、盛期、末期）、及栽培管理方面等对小孢子培养胚胎发生方面的研究还较少。
　　1.3供体植株小孢子的发育时期
　　芸薹属小孢子仅在特定的发育阶段适合小孢子培养。甘蓝型油菜小孢子胚胎发生频率最高的时期是在单核晚期阶段，而在其他芸薹属作物中，单核晚期至双核早期阶段的小孢子最适宜培养。宋立晓（2010）研究也表明青花菜处于单核晚期至双核早期的小孢子容易出胚。小孢子所处时期与花蕾的长度或者瓣药比呈比例关系，然而，这与植株的生长条件和时期有很大的关系。吴丽艳等（2009）认为当花蕾大小在3.6-4.5mm之间时，多数小孢子处于单核晚期和双核期，一般比例在50%以上，适宜小孢子培养。方淑桂等（2005）认为花蕾长度在4.1-5.0mm,花药为绿色,花药长度为花蕾1/2-3/5，镜检结果表明处于单核晚期和双核期的小孢子比例占50%以上时。通过国内外学者的研究表明，青花菜小孢子胚发生频率最高的时期是单核晚期至双核早期这个阶段，但由于不同的品种、生长条件等因素的差异，在培养的过程中，应先观察确定处于该时期的花蕾特征，然后进行取材，才易获取更多的胚。
　　2 预处理
采用一些物理和化学预处理能增强小孢子的胚胎发生能力，这些预处理很有可能促使游离培养的小孢子由配子体发育向孢子体发育方向转换。其中主要的预处理有温度（低温与高温）、秋水仙碱等。
　　2.1低温与高温预处理
　　2.1.1低温预处理
　　适当的低温预处理能提高小孢子胚的产量。不同的材料，低温预处理的最佳温度及最佳时间会有所差异。在青花菜小孢子培养中，宋立晓等（2010）研究结果表明4℃低温处理1d能提高小孢子胚胎的产量，时间过长，胚胎产量会下降。YUAN S X等（2011）研究结果表明4℃低温处理1-2d，均能提高小孢子胚胎的产量，而且与32.5℃处理相结合，胚胎的产量高于较单独使用任何一种处理。可能经过低温处理，提高小孢子的适应逆境的能力，从而提高了小孢子在培养的过程中的存活率。
　　2.1.2高温热激处理
　　高温热激处理在大多数芸薹属作物小孢子培养中是不可或缺的，在很多方法中，游离小孢子在转入25℃培养前，都要进行12-72h的30-35℃热处理。这主要是因为高温热激可以影响小孢子中微管的分布，促使小孢子对称均等分裂，从而由配子体发育途径转向孢子体发育途径。方淑桂等（2005）在进行青花菜小孢子培养时认为32℃热激处理1d效果最好。Takahata&Keller（1991）和宋立晓等（2010）的研究也均表明在进行25℃暗培养之前，32.5℃处理1d是青花菜小孢子培养获得高出肧率的关键。目前在青花菜小孢子培养中，学者们基本上使用32.5℃处理1d的热激预处理方式。
　　2.2其他方法
　　使用秋水仙碱能产生与热激处理同样的效果，陆瑞菊等（2006）使用500mg/L秋水仙碱预处理青花菜花蕾发现能提高出胚率和成苗率。杨安平等（2010）在甘蓝难出胚材料中适量添加秋水仙碱处理，使部分难出胚材料产胚，使易出胚材料产胚量提高。但在秋水仙碱的使用上，不同的材料处理时间与处理浓度上存在差异。
　　3 培养基
　　3.1基本培养基的种类
　　在众多培养基（MS、B5、NLN等）中，芸薹属小孢子培养应用最广泛是改良的NLN培养（modified Nitsch basal medium），较其他培养基的主要特点是大量元素含量低，低离子浓度有利于游离小孢子胚胎产生。Dias（2001）以10个基因型青花菜为试材，采用标准NLN培养基与1/2NLN培养基进行培养，结果发现高胚胎发生品种对主要盐类减低一半的NLN培养基有很好的响应。张延国和王晓武（2005）研究发现在1/2NLN培养基上所有11份青花菜均能出胚，而在NLN培养基仅1份材料出胚。这些研究表明减少培养基盐离子浓度对胚胎的产量产生及发育基本没有任何不利影响。目前，多数研究人员基本选用低浓度的1/2NLN培养基作为青花菜小孢子培养的培养基。
　　3.2碳源
　　在小孢子培养中蔗糖是被广泛运用渗透压调节剂，并且作为碳源与能量来源。方淑桂等（2005）通过使用10%、13%、15%的蔗糖进行青花菜游离小孢子培养时发现13%蔗糖培养基出胚率最高，15%少量，10%则没有胚出现。陆瑞菊等（2006）使用17%的蔗糖高温热激处理，并培养3-4d，再转入13%蔗糖浓度培养基中，有利于提高胚状体的诱导频率[39]。这可能是由于高浓度形成的渗透压有利于小孢子存活和脱分化启动，而较低浓度（13%）则有利于多细胞结构的形成及胚状体的发育，同时更换培养基能减少了代谢过程中产生的有毒物质。在青花菜游离小孢子培养时，广大学者基本上均使用13%的蔗糖浓度。此外，蔗糖作为维持小孢子渗透压的调节剂这功能可以被高浓度的高分子量甘露醇或聚乙二醇(PEG-4000)替代,此时可以使用较低浓度的蔗糖，且小孢子出胚率几乎没有影响，不过目前采用该方法的研究报道还不是很多。
　　3.3植物激素与AgNO3
　　激素促进细胞的生长与分裂，小孢子培养中主要使用生长素和细胞分裂素这两大类，生长素诱导细胞分裂和根分化，主要包括2，4-D、NAA、IBA等；细胞分裂素主要促进细胞分裂、胚状体的形成及愈伤组织生根生芽，包括6-BA、KT、TDZ等。此外，AgNO3在小孢子培养中也常被使用，它主要作为一种极性诱导剂和抑制物，在游离小孢子培养的过程中，通过抑制乙烯的合成，从而促进胚的发生，提高胚的产量。培养基添加激素与否、激素的种类、及剂量，目前还没有统一的定论。多数学者认为不添加激素反而更有利于小孢子胚产量的提高。比如，冯翠等（2011）认为培养基中无添加剂比添加一定浓度6-BA和NAA青花菜小孢子产胚量高[6]；Takahata Y&Keller W A（1991）、张德双等（1999）、陆瑞菊等（2006）、YUAN S X等（2010）等在进行青花菜小孢子培养时也均没有使用各种激素及AgNO3，详见表1。也有部分学者研究认为适量的6-BA、2，4-D、AgNO3能提高小孢子的产量，而NAA抑制胚的产量。宋立晓等（2010）认为添加植物生长调节剂是不添加调节剂出胚量的2倍，其中0.05mg/L 6-BA、0.05mg/L 2,4-D、20mg/L AgNO3均可提高单蕾胚产量，但NAA则抑制胚产量的提高，不利于胚的发育；同时向培养基中加入0.05 mg/L 6-BA、20mg/L AgNO3、0.05 mg/L2,4-D小孢子单蕾产胚量最高。到底激素与AgNO3在小孢子培养的过程中所起的作用积极与否，作用机制是怎么样的，目前这方面的研究报道还比较少，因此在试验的过程中，应根据实际情况，谨慎使用。
　　3.4活性炭
　　活性炭（activated charcoal，AC）具有吸附作用，能吸附小孢子培养过程中产生的有毒代谢物质，但该吸附不具有选择性，也能吸附培养基中的营养物质,因此在进行游离小孢子培养的过程中添加活性炭的量要适宜，否则会抑制小孢子胚胎发生。张延国和王晓武（2005）以绿秀为例，加入活性炭每皿获得了316个胚，而不加仅有16个胚，相差很大。宋立晓等（2010）认为添加适量的活性炭对出易出胚的材料促进作用不是很明显，对难出胚材料促进作用明显，其中活性炭0.2mg/ml以下具有促进作用，以上则会抑制出胚，0.3mg/ml几乎没有胚出现。方淑桂等（2005）试验中添加0.05 mg/mL活性炭,产胚量最高；超过0.1 mg/mL，则不利于胚胎发育；无添加活性炭的小孢子胚状体发生量较多，但大多停留在球形期和鱼蕾期,成苗率低。总之，活性炭在小孢子培养中应用很广泛，详见表1，几乎在所有的试验中，均对其进行了研究，并证实适量的活性炭（c≤0.23g/L）能提高小孢子胚胎的产量。
　　3.6培养基的pH
　　培养基的pH对小孢子的培养至关重要，一般适宜的培养基pH范围为5.8-6.2。在pH对小孢子胚胎发生的影响方面的研究报道较少，仅冯翠等（2011）比较了四种梯度pH 5.8、6.0、6.2、6.4对产胚量的影响，认为培养基pH值6.2比较适合青花菜游离小孢子培养。此外，学者Takahata Y&Keller W A（1991）使用NLN培养基pH是6.0，Dias(1999)使用的NLN培养基pH是6.0，其他学者应以pH5.8的居多。
　　3.7添加和更换培养基
　　小孢子在培养过程中，产生有毒的代谢物质逐渐积累，并且随着时间的延长，培养基中的养分含量也逐渐降低，因此添加或更换培养基对小孢子培养有一定的促进作用。陆瑞菊等（2006）在青花菜小孢子培养初期使用17%高浓度蔗糖培养3-4d后更换成13%蔗糖浓度进行培养，发现可提高胚状体的诱导频率。顾宏辉等（2004）在进行花椰菜小孢子培养时也先用17%蔗糖浓度培养基热激培养24h后更换成10%浓度的培养基继续培养，发现能显著提高胚产量，减少愈伤状胚的形成。但更换培养基需要离心，这有可能会对小孢子产生损伤和污染。方淑桂等（2006）在进行花椰菜小孢子培养时研究发现，添加和更换培养基均能显著提高小孢子胚胎产量，且添加低糖浓度的培养液效果更显著[16]。在青花菜小孢子培养方面，就添加培养基浓度、时间上等方面研究报道还比较少，有待进一步探究。
　　3.8其他注意事项
　　3.8.1培养密度
　　小孢子培养过程中，适宜小孢子密度也至关重要，过大易导致培养液中的小孢子拥挤，产生过多的有毒物质，反而不利小孢子胚胎发生；小孢子胚胎发生能力较弱，若过低，可能达不到出胚胎发生需求的小孢子量或者影响产胚胎产量的高低。Huang等（1990）在油菜上进行了较为深入的研究，发现小孢子密度高于4×104个/ml,产生胚状体数量随密度的增加而增加，当超过1×105个/ml时，陪产量明显下降；同时，还发现易出胚材料，最低出胚的小孢子浓度可达3×103个/ml。在青花菜上，目前大多数学者广泛使用的密度是4×104-2×105个/ml。然而在实际试验操作过程中，使用血球计数板进行测定，比较繁琐耗时。因此许多学者大多都是通过预实验测定小孢子密度/ml对应的花蕾数/ml来进行试验，一般情况下，获得较好出胚效果为1.5-2蕾/ml。
　　3.8.2振荡
　　振荡能改善培养皿内的通气状况,减少有害代谢物质在胚状体周围积累,降低了畸形胚的形成。吴丽艳等（2009）对震荡转速及时间进行了较为深入的研究，认为静止暗培养10-12d后进行振荡培养，出胚率最高，早一点或者晚一点效果都不好。转速为40-60 r/min时出胚率较对照明显增高且子叶型胚的比例较高，随着转速的提高，子叶型胚的比例会降低。此方面与陆瑞菊等（2006）的研究一致，可能振速过高会影响到胚状体的发育且加速培养液的消耗,从而造成子叶型胚比例的下降。
　　4问题与展望
　　游离小孢子技术自问世至今，得到迅速的发展和广泛的应用，可在青花菜小孢子培养方面，当前的大多数研究主要集中在体系的建立与优化方面，在这方面相对来说还存在：1）使用的材料较少，不具有广泛的代表性；2）研究不够全面，游离小孢子培养技术本身就比较复杂，受到诸多因素的影响，很难在一个试验中能优化所有的因素；3）不同的学者，在试验操作的过程中也存在技术、经验等方面的差异。随着该技术逐渐成熟和完善，会在在青花菜种质资源创新、遗传结构分析、遗传转化等方面有更大的应用空间。
小孢子胚胎发生是个复杂的过程，是小孢子由配子体发育途径转换成孢子体发育途径，发育形成具单倍、双倍或多倍染色体组胚胎的过程。对小孢子胚胎发生机制的研究主要有：1)细胞学水平上发现，小孢子通过外界胁迫（预处理）等方式获得胚性，随之细胞内发生一些特有的形态学变化，如细胞膨大、液泡破裂、细胞质形态消失等，逐渐分裂发育成球形胚、心形胚、鱼雷形胚及子叶形胚；2)分子水平上，主要从mRNA和蛋白质水平上对胚胎发生的机制进行研究，然而到目前为止也仅有BBM基因被公认为具有诱导胚胎发生能力，其他基因（ECMt、ADH等）、蛋白（HSPs）在小孢子胚胎发生过程中是如何表达、调控等问题还不清楚。虽然已从细胞学水平和分子水上对小孢子胚胎发生机制进行了很多研究，但是至今还没有从基因水平上彻底揭示胚胎发生的机制。“小孢子胚胎发生是如何被诱导，这些基因是如何被启动、怎样调节、且这些基因的遗传机制是什么”。只有彻底的弄清楚这些问题，才有可能克服基因型的障碍，知道如何诱导小孢子胚胎发生，如何调节内外因素，提高游离小孢子培养胚胎发生频率，建立起稳定、高效、实用的技术体系，结合其他的生物技术，推动生物学研究进一步发展。