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基因枪介导转化法

发布时间:2014年03月04日 来源: 阅读次数:11269

  基因枪法,又称生物弹法或微粒枪法、微粒轰击法,是依赖高速度的金属颗粒将外源基因引入活体细胞的一种转化技术。它是继农杆菌介导转化法之后又一应用广泛的遗传转化技术。这种方法操作简单,效率高,适应性强。一次可以向数以千计的细胞导人基因,不受细胞、组织或器官的类型限制,此外其目标命中率高,因此格外受重视。基因枪根据其加速装置可分为火药式、电动式和气动式。
  基因枪介导转化法 - 简介
  人类早就梦想能够突破物种界限,按照人的意愿培育或改良动植物新品种。20世纪70年代,DNA重组技术的出现为人类愿望的实现提供了可能。在获得符合要求的基因之后,面临的是如何将基因导人所选择的细胞中,并使之稳定表达,出现所期望的遗传性状。其中,基因导人是关键的环节之一。随着动植物基因工程研究的相继开展,先后出现了化学介导、生物介导和物理介导等类型方法。在物理介导法中,有激光打孔、电击孔和基因枪等方法。
基因枪法,又称生物弹法或微粒枪法、微粒轰击法,是依赖高速度的金属颗粒将外源基因引入活体细胞的一种转化技术。它是继农杆菌介导转化法之后又一应用广泛的遗传转化技术。这种方法操作简单,效率高,适应性强。一次可以向数以千计的细胞导人基因,不受细胞、组织或器官的类型限制,此外其目标命中率高,因此格外受重视。基因枪根据其加速装置可分为火药式、电动式和气动式。
  利用火药爆炸或高压气体加速(这一加速设备被称为基因枪),将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中,然后通过细脑和组织培养技术,再生出植株,选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。与农杆菌转化相比,基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单,因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。
  基因枪介导转化法 - 介绍
  美国Cornell 大学最早研制了火药基因枪。1990 年,美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS-1000 系统。此后,高压放电、压缩气体驱动等各种类型的基因枪相继出现,并在实际应用中得到不断改进和发展,使基因枪转化法成为继农杆菌介导转化法之后又一广泛应用的转化技术。根据动力系统,可将基因枪分为3 种类型。第一类是利用火药爆炸力作为加速动力;第二类是以高压气体作为动力;第三类是以高压放电作为驱动力。尽管基因枪有各种不同的类型,但基因枪转化的基本步骤如下:①受体细胞或组织的准备和预处理;②DNA微弹的制备;③受体材料的轰击;④轰击后外植体的培养和筛选。
  基因枪转化率差异很大,一般在10-3~10-2之间。但有的报道其转化率高达2.0%,而有的报道仅有10-4。相对于农杆菌介导的转化率要低得多。而且基因枪转化成本高;嵌合体比率大;遗传稳定性差。此外,通过基因枪法整合进植物细胞基因组中的外源基因通常是多拷贝的,可导致植物自身的某些基因非正常表达,还可能发生共抑制现象(co-suppression)。即使这样,该方法得到了广泛应用,因其具有如下优点:①无宿主限制,无论是单子叶植物和双子叶植物都可以应用;②可控度高,操作简便迅速,商品化的基因枪都可以根据实验需要调控微弹的速度和射入浓度,命中特定层次的细胞;③受体类型广泛,原生质体、叶圆片、悬浮培养细胞、茎、根、以及种子的胚、分生组织、愈伤组织、花粉细胞、子房等几乎所有具有分生潜力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击;④可将外源基因导入植物细胞的细胞器,并可得到稳定表达。正因为基因枪这些优点,使基因枪成功的应用于植物基因转化,特别是单子叶植物的转化;外源基因导入植物细胞器等。
  基因枪介导转化法 - 影响因素
  1)不同浓度的CaClz对基因瞬时表达和稳定表达的影响。
  2)添加亚精胺溶液与未加亚精胺的轰击对基因瞬间表达影响不大。
  3)太高的氦气压力会对细胞造成不可逆的损伤。
  4)轰击次数对愈伤组织转化的影响很小。
  5)细胞处于不同的生理状态,初生愈伤组织细胞的结构紧密,细胞核大,质浓,而继代3个月后的愈伤组织逐渐老化,细胞液泡化程度高。
  6)在基因枪转化前24h分别用5、10、20Gy丁射线辐照处理愈伤组织。5Gy处理的基因瞬时表达明显增强,抗性愈伤比例比对照提高近l倍。
  肿瘤基因治疗研究中的应用
  基因枪在肿瘤基因治疗的研究主要在间接体外和体内两个领域。间接体外领域主要是瘤苗的研究,即在间接体外对肿瘤细胞转基因,经过照射使之失去增殖能力后,再回植到体内,以达到提高机体抗肿瘤免疫的能力。
  由于患者肿瘤手术切除标本非常难于在体外长期培养,而且即使获得长期培养物,肿瘤细胞表面存在的一些抗原性物质也可能已经发生了改变。所以,基因枪这种不需要长期体外培养的转基因手段在这些研究中具有很大的优势。
  植物基因转化中的应用
  目前,农作物基因工程正进入一个飞速发展的时期,越来越多的转基因植物和产品进入市场。不但可以利用基因枪技术种植具有特定农艺性状(如抗病、抗旱、抗寒、抗涝、抗虫、耐盐、耐药等)以及高质量食品(高蛋白、高油酸、含维生素等)的作物,而且也可以利用该技术来开发和利用具有特定用途(如生物制药)的植物。总之,有了这种高效的转化技术,作物复杂的生理生化性状等可望得到进一步的改良。

 


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